Оба полководца подготовились к сражению обстоятельно. Перед тем как сойтись в битве с Дарием, Александр захватил все близлежащие прибрежные города Средиземного моря, тем самым укрепив свой тыл и подпортив жизнь флоту противника; Дарий же собирал огромное войско, которое в итоге оказалось в три раза больше армии Александра — 40 тысяч воинов Македонского против 100 — 120 тысяч Дария. Противостоящие силы сошлись в ноябре (мемактерионе по аттическому календарю) 333 года до н. э. при Иссе — процветающем городке на берегу Средиземного моря. Сейчас эти территории относятся к турецкой провинции Хатай.
Поначалу армия Александра пробиралась по узкой береговой линии, прямиком к которой подступали горы. Дарий со своим многочисленным войском ждал, когда же противники выйдут на равнину, дабы сразиться с ними, но Македонский прекрасно понимал, что появление на открытой местности сыграет не в его пользу — Дарий попросту возьмет их числом. Именно поэтому Александр не торопился появиться на равнине и тем самым подписать смертный приговор своим солдатам.
Дарий, которому с трудом удавалось удерживать огромную армию в одном месте, был вынужден двинуться навстречу царю Македонии. Персидский правитель захватил город Исс, и его войско попало в тыл к македонцам. Тогда Александр развернул своих людей и лицом к лицу встретился с Дарием. Для многотысячной армии последнего то место, в котором в итоге состоялась битва, оказалось не слишком выгодным: морской берег здесь едва достигал двух с половиной километров. Римский историк Курций, автор «Истории Александра Великого Македонского», описал эти обстоятельства так: «Дарий же, повелитель такой огромной армии, из-за тесноты поля боя свел её к той самой малочисленности, за какую презирал врага».
Значительное численное превосходство не привело Дария к победе. Успех в этом сражении персидскому царю не сопутствовал. Довольно быстро Александр оказался в центре неприятельской линии, а затем и вовсе близ Дария. Македонский был легко ранен в ногу; погибли многие знатные персы, входившие в свиту царя и охранявшие его. По словам древнегреческого историка Диодора, воины Александра «навалили груду тел высотой до колесницы» Дария. Персидский царь, опасаясь за свою жизнь, решил бежать с поля боя. Примеру своего правителя вскоре последовали и многие его подданные. Свидетели этих событий отмечали, что вся прибрежная зона была усыпана трупами поверженных персов.
По легенде, бежавший Дарий, опасаясь преследования, приказал приближенным спрятать самые ценные его сокровища, дабы они не попали в руки солдат Александра. «Македоняне тогда впервые научились ценить золото, серебро, женщин, вкусили прелесть варварского образа жизни и, точно псы, почуявшие след, торопились разыскать и захватить все богатства персов», — писал об этом Плутарх. В 1973 году последний иранский шах Мохаммед Реза Пехлеви распорядился отправить экспедицию на поиски спрятанных драгоценностей, но их до сих пор не удалось отыскать.
При этом мать Дария, его жена и дети были захвачены в македонский плен. Супруга персидского царя умерла еще в пути, а на его дочери Статире Александр впоследствии женился.
Вскоре Александр покорил Финикию, Палестину и Египет. Победа над Дарием открыла Македонскому путь во все азиатские земли. Однако спустя два года ему вновь предстояло сразиться с персидским царем.