В биографии Ивана Фёдорова немало белых пятен; под знаком вопроса место и дата рождения. Он родился в период с 1510-го по 1530-й год. Некоторые исследователи высказали предположение, что книгопечатник происходил из шляхетского рода. В архивах Краковского университета сохранились данные о «бакалавре Иоанне Фёдорове, москвитянине».
Пока молодой человек учился, Иван Грозный пригласил из-за рубежа мастеров печатного дела. Одним из первых в Москву прибыл датчанин Ганс Мессингейм. Вместе с ним датский король Кристиан III прислал книги, в которых излагалось лютеранское учение, с предложением перевести их на русский. Также в Москву были привезены все необходимые для печатного дела материалы. Книги так и не перевели, зато началось строительство первой в России лютеранской церкви. Под руководством Мессингейма были анонимно изданы несколько книг. Вероятно, одним из его учеников стал Иван Фёдоров. В 1550-х следы датчанина теряются, его дальнейшая судьба неизвестна.
Печатный двор в столице располагался на Никольской улице. Напарником Фёдорова стал Пётр Мстиславец. В 1563—1564 годах они напечатали книгу «Апостол» из 267 листов. На каждой странице поместилось 25 строк. Использовались краски высокого качества, поэтому чёткость изображения со временем не пострадала. На гравюре на фронтисписе изображён евангелист Лука. В послесловии сказано: «Благоверный царь и великий князь Иван Васильевич всея Руси повелел святые книги на торгах покупать и в святые церкви вкладывать. Но среди них мало нашлось пригодных — все оказались испорчены переписчиками, невежественными и несведущими в науках. Тогда он начал размышлять, как бы наладить печатание книг, чтобы впредь святые книги издавались в исправленном виде».
Над «Апостолом» работали год. Фёдоров и Мстиславец вырезали деревянные орнаменты, отливали литеры разных шрифтов. Буквы были округлыми с наклоном вправо. Итальянский путешественник, оказавшийся в Москве, отмечал: «Я видел, с какой ловкостью печатались книги». Золотое тиснение, аккуратные рисунки — издание было настоящим произведением искусства. Следующим из печати вышел «Часовник». Работа над ним заняла меньше времени, однако книга уступала «Апостолу» в художественных качествах.
После издания «Часовника» Иван Фёдоров и его компаньон решили уехать из Москвы. Возможно, причиной послужила конкуренция со стороны переписчиков, чей «бизнес» оказался под угрозой исчезновения. Во всяком случае, книгопечатники не собирались в спешке, они взяли с собой всё необходимое, чтобы продолжить работу на новом месте. Сам Фёдоров писал о давлении со стороны московских священников и чиновников. Так или иначе, мастера переехали в Литву. Здесь они вели работу в Заблудовской типографии, где было издано «Учительное Евангелие». Книга получила широкое распространение в Речи Посполитой.
После закрытия Заблудовской типографии Иван Фёдоров переехал во Львов и затем в Острог, где в 1581 году напечатал «Острожскую Библию». Книга была издана тиражом до 1500 экземпляров и состояла из 628 листов (104 тетрадей). В «Острожской Библии» использованы 6 шрифтов. Впоследствии экземпляр этой книги Иван Грозный подарил английскому послу Джерому Горсею. До наших дней сохранилось более 300 экземпляров «Острожской Библии».
Известно, что Иван Фёдоров путешествовал по Европе. В декабре 1583 года книгопечатник скончался, его похоронили во Львове.