Джеймс был сыном короля Шотландии Якова V и, соответственно, приходился Марии братом. Братом, впрочем, сводным и незаконнорожденным: очередного ребенка — одних лишь внебрачных детей у монарха было не менее семи — Якову подарила Маргарет Эрскин. Казалось, путь к престолу для Джеймса был закрыт, однако обстоятельства в конце концов привели его к намеченной цели. Во время регентства Марии де Гиз при ее несовершеннолетней дочери Марии I Стюарт Джеймсу удалось оставаться у королевы-матери на хорошем счету: он поддерживал вдову Якова V и имел с этого различные дивиденды. Все изменилось в середине 1550-х годов.
Джеймс ударился в протестантизм и решил во что бы то ни стало усилить его позиции в Шотландии. Он примкнул к протестантам, восставшим в 1559 году, и даже приблизился вплотную к трону — в Англии всерьез обсуждали вариант его восхождения на престол. Однако же шотландские бароны к такому развитию событий оказались не готовы: в 1561 году они поспособствовали возвращению на родину Марии Стюарт, находившейся все это время во Франции.
После приезда Марии Джеймс также остался на первых государственных ролях. Королева собственноручно вырыла себе яму и дала сводному брату слишком много политической свободы. Он начал действовать в собственных интересах и претворять в жизнь протестантские реформы. Правда, все изменилось после свадьбы Марии и лорда Дарнли. Политика Джеймса Стюарта была свернута, а сам он вынужден был отойти от дел. Чтобы, впрочем, вскоре вернуться к ним снова.
Джеймс тщательно обдумывал заговор против королевы, и поводом для ее свержения стало загадочное убийство короля-консорта. Обстоятельства этого происшествия до конца не ясны: то ли королева решила избавиться от надоевшего супруга, то ли сам Джеймс спланировал убийство, дабы скомпрометировать сестрицу, — версий, как водится, масса. Важно лишь то, что доверие баронов и английской монархини королева после этого случая и нового замужества утратила. Мария была вынуждена отречься от престола, что она и сделала в июле 1567 года. Наследовал Марии ее сын Яков, однако в силу возраста — мальчику был всего год — необходим бы регент. Им и стал Джеймс Стюарт.
Королеву же отправили в заточение в замок Лохливен, откуда ей спустя некоторое время удалось бежать и даже собрать армию, которая и была разбита при Лангсайде. Джеймс после этого лишь укрепился во власти, был признан Англией и получил от Елизаветы I немалую сумму. Правил, впрочем, Джеймс Стюарт не так уж долго: в 1570 году он и сам оказался в эпицентре заговора и был убит одним из союзников Марии. В Шотландии же началась гражданская война. Мария ко власти так и не вернулась: за графом Мореем последовала целая вереница регентов.